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無菌工藝模擬試驗指南（無菌原料藥）
1. 目的
為指導和規范無菌原料藥生產企業開展無菌工藝模擬驗證，充分評價無菌原料藥生產過程的無菌保障水平，確保無菌原料藥的安全性，依據《藥品生產質量管理規范（2010年修訂）》及附錄，制定本指南。
2. 定義
本指南所述的無菌工藝模擬試驗，是指采用適當的培養基或其他介質，模擬原料藥生產中無菌操作的全過程，評價該工藝無菌保障水平的一系列活動。
3. 范圍
3.1 本指南涵蓋了無菌工藝模擬試驗的基本要求、不同工藝模式的相應要求、試驗的基本流程和結果評價等內容，適用于無菌原料藥的無菌工藝驗證。
3.2 本指南所述條款是在現有無菌工藝技術基礎上提出的相關要求，旨在規范企業開展無菌工藝模擬試驗活動。在科學的基礎上，鼓勵新技術、新設備的引入，進一步提高無菌原料藥的無菌保障水平。
4. 原則
在對無菌生產工藝充分認知和生產經驗累積的基礎上，應結合工藝、設備、人員和環境等要素定期開展無菌工藝模擬試驗，以確認無菌生產過程的可靠性。同時也為企業及時識別風險，進而改進無菌控制措施提供數據支持。開展無菌工藝模擬試驗應遵循以下原則：
4.1 基于無菌工藝設計，對無菌生產全過程實施風險評估，識別生產過程風險點，評估現有控制措施的有效性。模擬試驗方案設計時，應充分考慮風險評估的結果。
4.2 應充分考慮硬件裝備水平與無菌風險的關聯性，結合無菌生產過程所涉及到的工藝、設備、人員以及操作時限等因素針對性開展模擬試驗，盡可能模擬實際無菌生產全過程，應特別關注暴露操作、人工干預等高風險過程。
4.3 如生產線有多種無菌生產工藝，應采用風險管理的模式，在綜合評價不同無菌生產工藝的基礎上設計模擬試驗方案，以評價每種無菌工藝過程的可靠性。
4.4 如無菌生產工藝存在顯著差異，宜對每種工藝開展模擬試驗。
5. 無菌原料藥生產工藝及模擬范圍
無菌原料藥的無菌生產工藝通常為：原料藥進一步精制和無菌操作的結合，作為無菌原料藥生產工藝的開始，多采用除菌過濾或其他除菌技術將物料中的微生物去除，之后采取無菌操作技術的工藝單元，最終獲得免受微生物污染的原料藥。無菌工藝模擬試驗應從第一步無菌操作開始，即經除菌過濾或其他方法獲取無菌藥液，直至無菌產品完全密封結束。
與無菌制劑工藝相比，無菌原料藥的生產工藝一般更復雜，工藝設備選型呈現出非標化和功能設計差異化等特點。即使是同一無菌工藝過程，因設備選型和系統密閉程度的不同，無菌風險也存在著顯著差異。
目前，無菌原料藥常用無菌工藝包括：無菌結晶工藝、無菌冷凍工藝和無菌噴霧干燥工藝。
5.1 無菌結晶工藝
典型的無菌結晶工藝流程是從非無菌物料開始，經除菌過濾進入無菌結晶罐內，通過調整物料溫度或加入其他溶劑使物料中有效活性成分結晶或沉淀析出，該過程會因控制晶體生長的需要而引入晶種。養晶結束后進入固液分離設備，去除母液獲得濕品，必要時對濕品進行洗滌，濕品在固液分離設備內進行干燥或通過輔助密閉系統轉移至其他干燥設備內進行干燥，之后根據產品特性和最終質量要求進行必要的整粒（或微粉化），以控制產品粒度大小和分布，混粉也是常用的工藝單元，主要解決產品均一性的問題。最后產品經分裝、密封，將產品嚴封于容器內。
5.2 無菌凍干工藝
常見的無菌凍干工藝流程包括：液體物料經除菌過濾得到無菌料液，在無菌防護下使用加料槍將無菌料液注入凍干機托盤內，按照規定程序進行冷凍真空干燥，干燥結束后經除菌級呼吸器釋放凍干機內的真空。在無菌防護下打開凍干機門，將干品由托盤轉移至無菌料倉內，或在無菌防護下通過真空密閉吸料系統將干品轉移至下一工序，干品通常需要整粒和混粉工藝，以得到質量均一的干品，最后經分裝、密封，將產品嚴封于容器內。
5.3 無菌噴霧干燥工藝
無菌噴干工藝適用于耐熱性好的無菌原料藥，工藝流程通常包括：液體物料經除菌過濾后持續穩定地注入干燥塔內，在無菌高壓空氣的作用下瞬間霧化成液滴，并與流動的無菌熱空氣發生傳質傳熱，液滴因水分迅速蒸發而變為粉末狀干品，獲得的干品經氣固分離器收集至無菌料倉內，或直接分裝至最終市售包裝內。產品在料倉內可實現進一步混粉操作，隨后經分裝機完成干品的分裝、密封等過程，將產品嚴封于容器內。
5.4 密閉與開放系統
通常無菌工藝由一系列的無菌單元操作組成，單元操作分為“密閉”或“開放”系統，采用“密閉”系統可更好的保障無菌水平。
5.4.1 “密閉”系統
“密閉”系統是通過物理隔離的方式，阻止環境中微生物進入系統內部，保護藥品免受外界的污染。因“密閉”系統設計上的優越性，在無菌操作過程提供了可靠的無菌保護措施。企業進行無菌原料藥工藝設計時，應盡量考慮采用“密閉”系統的可行性。“密閉”系統至少具備以下特征：
5.4.1.1 能夠實現在線滅菌（SIP）或系統在使用前進行密閉和滅菌。
5.4.1.2 能夠在一個生產周期內保持系統的完整性。且在與其他密閉系統連接時，能夠保持系統完整性不受破壞。
5.4.1.3 在實施預防性維護過程中，有相應措施保護系統的完整性。
5.4.2 “開放”系統
“開放”系統是不符合“密閉”系統規定的一項或多項特征的系統，“開放”系統條件下進行的操作是影響最終藥品無菌特性的重要環節，如設備（或管道）的無菌連接、分裝過程容器的更換等，是引入微生物污染的高風險過程。模擬試驗方案設計時應重點考察以上過程中無菌保障措施的有效性。
6. 模擬試驗方案的設計及實施過程要求
模擬試驗是一個系統性工程，通過模擬無菌生產工藝全過程，證實生產過程中無菌保障措施的有效性。因此，模擬試驗實施應關注以下幾方面：
6.1 開展模擬試驗的前提條件
開展無菌工藝模擬試驗之前，應確認與無菌工藝相關的支持性系統和滅菌系統等驗證已完成，并達到了可接受的標準。
6.1.1 工藝設備、公用系統和輔助設施按照預期要求完成了設計、安裝、運行確認及與無菌生產有關的性能確認。
6.1.2 已對工藝設備、公用系統、輔助設施等的滅菌方法完成了相應的驗證，物料及廠房、設施所用消毒劑及消毒方式完成了相關的驗證。
6.1.3 藥液及與產品接觸的氣體、設備組件、容器具滅菌工藝完成了相應的驗證。
6.1.4 無菌生產區域的氣流及環境達到了設計要求，并能穩定運行。依據規定的消毒方法和頻次進行環境消毒，應避免消毒劑的過度使用。
6.1.5 根據無菌生產工藝要求建立了相關文件。
6.1.6 參與無菌工藝模擬試驗的人員接受了藥品GMP、無菌更衣、無菌操作、微生物知識和模擬試驗方案的培訓。
6.1.7 進入無菌潔凈區的全部人員通過了更衣程序的確認，并采取文件或其他措施，確定了每位參與者可進入的區域和允許的無菌操作項目。
6.2 基于無菌風險的模擬試驗方案設計
模擬試驗方案設計應結合無菌生產工藝，盡量與實際無菌操作過程保持一致，以求試驗結果真實反映生產過程的無菌保障水平。
6.2.1 無菌生產工藝的風險評估
無菌生產工藝的設計基于對產品特性、工藝技術和無菌保證措施的認知和經驗的累積，設計模擬試驗方案前應對無菌生產工藝開展系統性風險評估，以充分識別無菌生產過程中潛在風險點，方案設計時充分考慮風險評估的結果。
6.2.2 模擬試驗方案設計時，應重點考察和評估高風險無菌操作過程，如溶媒結晶工藝中引入晶種的過程。無菌生產工藝的暴露操作是影響最終原料藥無菌特性的重要環節，如設備（或管道）的無菌連接、無菌容器的轉運和更換、灌裝等關鍵操作。
6.2.3 證實人員的無菌操作能力能夠滿足無菌生產要求，是實施模擬試驗的目的之一。模擬試驗方案設計時，應結合工藝過程中的開放系統，重點考察人員的無菌操作過程，評價人員無菌操作素養和防護措施的可靠性。
6.3 模擬介質的選擇與評價
6.3.1 模擬介質的選擇
應考慮模擬介質與無菌工藝的適宜性，結合被模擬產品的特點以及模擬介質的可過濾性、澄清度、滅菌方式等方面選擇模擬介質，以盡可能模擬無菌生產全過程。不應選擇明顯具有抑菌性的模擬介質，以確保模擬試驗結果的可信度。通常可采用的模擬介質包括：促進微生物生長的培養基和安慰劑。
6.3.2 培養基的選擇
6.3.2.1 胰酪大豆胨液體培養基（TSB）是一種廣譜性培養基，特別對無菌工藝環境中源自人體的細菌、芽孢和真菌有良好的促生長效果，是無菌工藝模擬試驗常用的培養基。
6.3.2.2 如果產品需充入惰性氣體、儲存在無氧條件，無菌操作在嚴格的厭氧環境中進行時（即氧氣濃度低于0.1%），應考慮采用厭氧培養基，如硫乙醇酸鹽液體培養基（FTM），也可選擇其他適宜的培養基。在厭氧的無菌工藝環境監控中反復發現厭氧微生物或在產品無菌檢查中發現厭氧微生物時，應考慮增加厭氧培養基開展模擬試驗。
6.3.2.3 用于模擬抑菌性產品的培養基，如有必要需評估抑菌性產品殘存對其促生長能力及模擬試驗結果的影響。
6.3.2.4 包含動物來源成分的培養基，應考慮培養基引入外源污染的風險。如BSE（可傳染性海綿腦病）、TSE（瘋牛病）等風險，亦可選用植物來源的培養基。
6.3.3 培養基的配制
6.3.3.1 模擬試驗的培養基應在適宜區域進行準備，需注意培養基粉塵在環境中的擴散、殘留及去除，防止其殘存于環境及設備表面而造成微生物滋生。通常按照藥典要求或廠商提供的配制方法配制培養基。配制后的培養基應盡快滅菌或除菌過濾。
6.3.3.2 培養基在模擬試驗前應恢復至室溫，即用型無菌液體培養基儲存和使用條件應遵循生產商要求。
6.3.4 培養基的除菌與滅菌
6.3.4.1 除菌過濾
由于培養基的特性與藥液有差異，培養基除菌過濾的濾器型號可與產品使用的過濾器不同。如因培養基顆粒或生物負載較大等原因引起除菌過濾器堵塞時，可增加預過濾。應考慮降低非無菌培養基中細菌和霉菌生長的風險，以避免微生物生長導致培養基過濾性能的降低。此外除菌過濾的方式無法避免支原體污染，濕熱滅菌或輻照滅菌有助于降低該潛在風險，必要時可配合除菌過濾聯合使用。針對以上情況應進行風險評估并采取合理應對措施。
6.3.4.2 濕熱滅菌
在濕熱滅菌過程中應考慮避免受熱不均勻或滅菌不充分現象。應對該滅菌方式進行風險評估和驗證，也可使用無菌干粉或液體成品培養基。
滅菌過程應遵循生產商推薦的滅菌時間和溫度的建議，并對滅菌過程予以驗證。確保滅菌后培養基的促生長能力，避免過長時間及過熱滅菌使培養基碳化造成其促生長性能的降低，應進行促生長能力試驗。
6.3.4.3 輻照滅菌
使用輻照滅菌的培養基粉末，應在適宜環境下進行配制等操作。輻照滅菌過程應經過驗證，并在產品質量報告中體現驗證所用的菌種和劑量等信息。
6.3.5 培養基促生長能力試驗
6.3.5.1 應在無菌工藝模擬試驗前及14天培養后按照現行中國藥典方法對培養基進行促生長能力試驗。
6.3.5.2 按照中國藥典要求，培養基促生長能力試驗使用的菌種包括：白色念珠菌（CMCC98001）、黑曲霉（CMCC98003）、枯草芽孢桿菌（CMCC63501）、金黃色葡萄球菌（CMCC26003）、銅綠假單胞菌（CMCC10104）和生孢梭菌（CMCC64941）等。除標準菌株之外，還可考慮加入環境和無菌檢查中發現的典型微生物。促生長試驗接種量應小于100CFU。按照中國藥典要求進行培養，證明培養基能夠支持微生物的生長。
6.3.6 其他模擬介質的選擇及評價
6.3.6.1 其他模擬介質的選擇
對于無菌粉末及特殊產品，可根據產品特性、無菌工藝、生產設備及模擬介質特點，也可選用其他模擬介質，如安慰劑。模擬介質的流動性應盡可能類似于被模擬產品，易于灌裝/分裝等無菌操作。模擬介質還應具有易于滅菌，無抑菌性，易溶解等特性。常用模擬介質有聚乙二醇、乳糖、甘露醇、氯化鈉、凡士林等。模擬介質的滅菌過程應經驗證并提供相關報告，其內容包括滅菌方式對模擬介質特性有無不良影響，滅菌后的無菌性。模擬介質的包裝形式應與被模擬產品的包裝形式保持一致。
6.3.6.2 其他模擬介質的評價
在使用模擬介質前應對其適用性進行確認，包括抑菌試驗、溶解度試驗等，如選用無菌模擬介質還應進行無菌試驗。抑菌試驗通常使用枯草芽孢桿菌（CMCC63501）和白色念珠菌（CMCC98001）。除此之外，還應考慮加入環境和無菌檢查中發現的典型微生物。無菌模擬介質用無菌水分散后，加入到無菌培養基中，達到模擬工藝選用的濃度范圍，然后每份培養基中接種10—100CFU。陽性對照接種到不含無菌模擬介質的試管中，按照現行中國藥典要求培養7天，所有試管應明顯微生物生長。
6.4 模擬灌裝的數量和持續時間
6.4.1 無菌工藝模擬灌裝的數量應足以保證評價的有效性及完成模擬方案中設計的各種干預活動，通常模擬灌裝的數量不宜低于正常生產分裝數量。
6.4.2 應對所設計的模擬方式、持續時間、灌裝的數量、預期收率作出合理說明。
6.4.3 模擬試驗所用模擬介質的量，應能夠覆蓋無菌工藝設備的全部內表面，特別是混粉過程，應確保模擬介質覆蓋混粉器內壁全部表面。
6.4.4 考慮到模擬最差條件的需要，模擬關鍵無菌操作過程的維持時間不應低于實際生產用時。
6.5 容器裝量
容器中培養基灌裝量應考慮適宜微生物生長的需要和容器內表面覆蓋的要求，灌裝量不必與產品相同。適宜的裝量既可保證產品通過倒置和旋轉接觸到容器所有內表面，又有足夠的氧氣支持微生物的生長。
6.6 模擬試驗方法的選擇
通常無菌原料藥生產工藝由多個工藝單元構成。模擬試驗方案的設計應考慮試驗過程可連續性問題，并確定采用連續工藝模擬還是分段模擬。
6.6.1 連續工藝模擬方式
6.6.1.1 這種模擬方式是將整個無菌過程視為一個整體，模擬介質不間斷地完成各個單元操作，并在最終分裝容器內進行無菌培養和判定，以評價生產過程的無菌保障水平。
6.6.1.2 連續工藝模擬方式的選擇，取決于模擬介質在模擬過程中的適用性，如噴霧干燥工藝可采用液體模擬介質，通過模擬噴霧干燥過程，可將液體模擬介質轉化為固體模擬介質，進而實現分裝、密封等過程的模擬。
6.6.1.3 連續工藝模擬可以真實反映整體無菌保障水平。但也有其不足之處，如發現污染，調查污染源的難度較大。
6.6.2 分段模擬方式
6.6.2.1 分段模擬方式是將無菌生產過程按照工藝單元分割成若干段，逐段進行模擬試驗，分段數量取決于工藝過程和模擬介質。模擬試驗最終的結果是各段獨立模擬試驗結果的累積，對一些無菌工藝而言，如結晶工藝，可根據需要變換采用液體或固體模擬介質，保持與實際工藝過程的一致性。
6.6.2.2 分段工藝模擬的優點是可以特定評價某一單元操作的無菌風險，如發現微生物污染，相對于連續工藝模擬更易于發現污染源，進而采取針對性糾正措施。
6.6.2.3 分段模擬方式也有不足之處，如：需要更多種類或數量的模擬介質；模擬介質需要多次無菌化處理，增加潛在污染風險；需要采集更多的物料、環境和人員監測樣本進行評價。
6.7 最差條件的選擇
最差條件并不是指人為創造的超出允許范圍的生產狀況和環境。為了確認無菌工藝風險控制的有效性，應通過風險評估并結合無菌生產工藝、設備裝備水平、人員數量和干預等因素來設計模擬試驗的最差條件。包括但不限于以下方面：
6.7.1 人員
應充分考慮人員及其活動對無菌生產工藝帶來的風險，如模擬生產過程的最多人數，當操作人員數量減少可能導致其他方面污染風險增加時，則此類條件也視為最差條件之一。參與人員應包括日常參與到無菌生產的全部人員，如生產操作、取樣、環境監測和設備設施維護人員，同時應考慮以上人員交叉作業、班次輪換、更衣、夜班疲勞狀態等因素。
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